茶树PPO粗酶液的制备。取20 g龙井43号一芽二叶，按料液质量比1:2，加入预先冰浴冷却的含5% PVP、Ph 7.2的柠檬酸－磷酸盐缓冲液（0.05 mol/L），冰浴研磨，4 ℃隔夜浸提12 h，于4 ℃、9000 r/min离心30 min，取上清液，滤纸过滤后，即制得粗酶液。

茶树PPO硫酸铵分级沉淀。PPO粗酶液按10%、20%、30%、70%、80%、90%饱和度依次递加硫酸铵，4 ℃静置，10%~30%的硫酸铵分别静置3 h，70%~90%的硫酸铵分别静置6 h。每个梯度静置后于4 ℃、9000 r/min离心30 min，上清液加硫酸铵至下一饱和度，各浓度沉淀加适量缓冲液溶解保存，测定沉淀物中酶活，确定硫酸铵分级沉淀的最佳条件。

茶树PPO离子交换层析。取脱盐浓缩的酶液加入平衡好的层析柱，加样完成后，依次用含0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲溶液洗脱，280 nm下测定吸光值，直至吸光值平稳后换下个梯度，各梯度洗脱2~3个柱体积。收集峰值附近洗脱液，超滤浓缩后于4 ℃保存，测定酶活并进行凝胶电泳分析。

茶树PPO凝胶过滤层析。取离子交换层析后得到的浓缩酶液加入平衡好的层析柱，加样完成后，用磷酸盐缓冲液（0.02 mol/L、pH 7.2）洗脱，280 nm下测定吸光值，收集洗脱液。取峰值附近洗脱液，超滤浓缩，４℃保存备用，测定酶活并进行凝胶电泳分析。

PPO蛋白脱盐与浓缩。以超滤离心管进行PPO蛋白脱盐或浓缩，硫酸铵沉淀溶解物、离子交换洗脱液、凝胶过滤层析洗脱液均分别加入超滤管中，于4 ℃、3500 r/min，离心，脱盐或浓缩。

PPO 非变性蛋白电泳。PPO同工酶采用非变性凝胶不连续垂直板电泳法，浓缩胶质量分数为4%，分离胶质量分数为 7.5%，每孔上样量为20 μL。预电压为稳压50 V，当溴酚蓝指示剂进入分离胶后将电压调至稳压110 V，冰浴条件下进行电泳。结束 电 泳 后，将 凝 胶 置 于 染 液 （60 mL 1%邻 苯 二酚，20 mL 0.6 g/L对苯二胺，20mL pH 7.2的0.05 mol/L 磷酸缓冲液）中室温染色３０ ｍｉｎ，蛋白胶用蒸馏水冲洗、浸泡至PPO同工酶带清晰为止。

PPO变性蛋白电泳。PPO蛋白纯度采用变性凝胶不连续垂直板电泳法，浓缩胶质量分数为4%，分离胶质量分数为12%，每孔上样量为20 μL。开始电压为60 V，在溴酚蓝指示剂进入分离胶后将电压调到120 V。当溴酚蓝指示剂距分离胶底面1 cm左右时结束电泳，然后进行考马斯亮蓝染色。

（摘自本课题组毕业硕士研究生许雷文章）